Resumen

El estudio de la prevalencia durante la fermentación alcohólica llevada a cabo para diferentes cepas de levadura aisladas en uvas y mostos procedentes de diversas regiones vitivinícolas españolas como Castilla La Mancha, Cataluña y Rioja, ha permitido la selección de una cepa peculiarmente idónea para la elaboración de vinos tintos con un perfil definido por las características propias de los vinos tintos actuales: alto grado alcohólico, rico carácter fenólico y un perfil aromático varietal definido.

Una nueva estrategia de selección desarrollada utilizando en la primera fase del estudio una técnica de identificación basada en PCR/RFLP de las regiones ITS, a permitido estudiar las características enológicas de la cepa V1F1B, aislada por la Estación de Viticultura y Enología de Navarra (EVENA) de mosto procedente de uva tempranillo de La Rioja y seleccionada por la Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia en un trabajo desarrollado en colaboración con el Departamento de Investigación y Desarrollo Biotecnológico de AEB-Group.

Las cualidades principales de esta cepa muestran unas cinéticas de fermentación rápidas y regulares incluso con grados probables elevados, próximos a 15 % vol. y temperaturas de fermentación en torno a 30º C, condiciones que dificultan los finales de fermentación. Así mismo se verifica que se trata de una cepa no demasiado severa en cuanto a su demanda nutricional, característica que le atribuye un carácter de supervivencia elevado.

La cepa V1F1B ha sido utilizada en la vendimia 2004 con la denominación de Fermol Grand Rouge Nature, con excelentes resultados de vinificación en los que se confirma como una cepa peculiarmente idónea para el desarrollo de fermentaciones con cinéticas regulares en las que se busca perfilar y potenciar en los vinos un perfil aromático típico.

Palabras clave: levadura, prevalencia, tempranillo, fermentación alcohólica.

Introducción

La afirmación categórica de Pasteur en su Estudio del Vino de 1876 sobre la influencia determinante que la levadura tiene sobre las cualidades finales del vino ha fomentado sin lugar a duda una creciente actividad investigadora de selección de cepas de levadura con carácter enológico específico definido.

En función de las cualidades principales que se busca destacar para cada variedad de uva sometida a elaboración, se persigue la búsqueda de cepas de levadura que tengan una evidente capacidad para complementar o potenciar en su caso el carácter específico primordial que ha de describir al futuro vino. Sin embargo, y a pesar esta evidencia, es sabido que las levaduras se desarrollan, no en pocas ocasiones, en un medio poco propicio para verificar la explotación óptima de sus características metabólicas, con la consecuente reducción cualitativa y cuantitativa de los descriptores típicos que generan.

En el caso de la vinificación en tinto, además, nos encontramos con un medio propicio para el desarrollo simultáneo y convivencia de diversas cepas de levadura, en función de la variabilidad de las condiciones del medio. Esto permite la convivencia de una diversidad de flora indígena a lo largo del desarrollo de la fermentación alcohólica, viéndose frecuentemente dificultada la implantación de una sola cepa.

El estudio y caracterización de una variedad de cepas involucradas en el desarrollo de fermentaciones espontáneas de nueve mostos de distintas variedades tintas procedentes de diversas zonas de España ha corroborado esta tendencia significativamente, salvo excepciones que definen el carácter de prevalencia de una de las cepas sujeta estudio.

Objetivos

• Estudiar mediante análisis molecular la relación entre levaduras existentes en una fermentación alcohólica espontánea.
• Singularizar las cepas de levadura que son capaces de obtener la prevalencia sobre otras cepas para desarrollar el proceso de selección.
• Estudiar las cinéticas de fermentación a nivel industrial así como el perfil aromático de los vinos obtenidos con la cepa seleccionada.

Procedimiento

1. Fase de selección

La única manera de verificar que una cepa de levadura es dominante es estudiar la ecología de la fermentación alcohólica espontánea sin condicionar el carácter prevalente por la influencia de una alta concentración celular de levaduras promovidas por la práctica del inóculo.

El estudio de la ecología de levaduras durante fermentaciones alcohólicas espontáneas en tinto se realiza para diferentes mostos de procedencias diversas. Las zonas seleccionadas para este estudio son Cataluña, Mancha, Aragón y Rioja, buscando mostos de características análogas, principalmente una alta concentración en azúcares fermentables, que desarrollarán vinos de alta graduación.

De estas zonas se seleccionan nueve bodegas que trabajan con distintas variedades de interés para la realización del estudio y de las cuales se conoce su tecnología de vinificación. Colaboran así mismo tres centros de investigación para realizar el proceso de aislado de colonias de levadura.

Las muestras de uva o mosto fresco, refrigerado o congelado se recepcionan en cada uno de los centros de investigación, que realizan el control de la adición de anhídrido sulfuroso a razón de 50 mg/l.

Las microfermentaciones se realizan en matraces estériles de 5 l de capacidad. Se desarrolla un registro de temperaturas y evolución del consumo de azúcares, programando los muestreos a lo largo del transcurso de la fermentación en dos fases:

• Fase I. Muestreo a una densidad de fermentación que suponga una concentración de glucosa y fructuosa de entre 130-140 g/l
• Fase II. Muestreo a una densidad de fermentación que suponga una concentración de glucosa y fructuosa de entre 10-30 g/l

Durante las tres horas siguientes al muestreo se aplica la muestra en una placa con dilución decimal -5,-6,-7 y se procede a la incubación a 28º C. Cuando las colonias se han desarrollado, en un plazo de 48 horas, se muestrean aleatoriamente seis colonias de cada placa en las que exista un número de colonias no inferior a las treinta.

Finalmente las colonias así aisladas se inmovilizan en sustrato agar /extracto de malta y se conservan para su posterior caracterización mediante análisis molecular. Cada una de las colonias se identifica según el origen del mosto y la fase de muestreo durante la fermentación.

La caracterización de las cepas estudiadas en estas fermentaciones espontáneas permite identificar aquellas que manifiesten un carácter prevalerte en una o ambas fases de la fermentación en las que se realiza el muestreo. Una vez caracterizadas las cepas prevalentes se realiza su selección de acuerdo con el estudio de los parámetros enológicos tradicionales.

2. Estudio de las cinéticas de fermentación y perfil aromático

Durante la vendimia 2004 se realiza el seguimiento de 16 fermentaciones industriales para la variedad tempranillo inoculadas con la cepa V1F1B en cuatro bodegas de la zona de La Rioja para evaluar el desarrollo de sus cinéticas de fermentación.

Homogeneizando en lo posible las pastas para eliminar el efecto matriz, simultáneamente se trabaja con una levadura de referencia LEV3 comúnmente utilizada en La Rioja para tempranillo para evaluar así las diferencias obtenidas con la nueva cepa utilizando exactamente las mismas condiciones de elaboración. El esquema de elaboración propuesto se resume en la figura 1.

Los racimos de uva de la variedad tempranillo tras el estrujado son tratados con 5 g/Qm del enzima Endozym Rouge para mejorar la extracción de materia colorante; este formulado posee una actividad de 11 000 uP/ g y 280 uCMC/ g. Se realiza el encubado y se inocula la levadura seca activa Fermol Grand Rouge Nature (cepa V1F1B) en un a dosis de 20 g/ hl. Al inicio de la actividad fermentativa se incorporan 20 g/ hl del formulado nutricional Enovit a base de fosfato amónico, sulfato amónico y tiamina, suficiente para asegurar la demanda de nitrógeno fácilmente asimilable en la fase de inicio de fermentación.

Se realiza el seguimiento de la evolución de la densidad y temperatura de fermentación para todos los casos.

A una densidad comprendida entre 1 040 y 1060 se incorpora en una sola adición, simplificando para facilitar su aplicación, una dosis de 15 g/ hl del formulado de tanino condensado/ hidrolizable Fermotan. Esta práctica conjuntamente con la aplicación de un delestage a un tercio de fermentación agiliza extracción y la posterior estabilización de la materia colorante. Se practica además al menos un remontado con aireación diario hasta prácticamente concluir la fermentación.

Se descuba al final de la fermentación y se produce le prensado de las pastas, tomando muestras de los vinos obtenidos para realizar los análisis de los compuestos aromáticos mediante cromatografía de gases acoplada a espectrómetro de masas GC-MS, utilizando microextracción en fase sólida SPME y desorción térmica en el inyector del cromatógrafo.

Entre los compuestos analizados se incluyen ésteres etílicos de ácidos orgánicos, alcoholes superiores y sus acetatos, terpenos, lactonas y fenoles volátiles.

Resultados

1. Fase de selección

La caracterización analítica de los mostos de partida evalúa los parámetros siguientes:

• concentración en azúcares fermentables (glucosa + fructuosa) g/l,
• grado probable estimado (refractometría) % vol.,
• acidez total ( g/l en ácido tartárico) y pH,
• anhídrido sulfuroso total mg/l

Las microfermentaciones espontáneas estudiadas han dado como resultado unas cinéticas de fermentación regulares en la práctica totalidad de los casos salvo en las fermentaciones BOD5 y BOD6 que presentan saltos irregulares en su cinética de fermentación como se aprecia en la figura 2.

La temperatura de fermentación se mantiene en un rango de 25- 30 º C en los nueve casos siendo la duración media de las fermentaciones de 8 días, durante los cuales se realizan los muestreos de colonias definidos para la Fase I y Fase II.

El muestreo de estas microfermentaciones desarrollado durante las fermentaciones espontáneas genera para la fase I y II un campo de 108 colonias aisladas que se codifican, atendiendo a una nomenclatura específica según su origen, en la tabla 2.

El estudio de las colonias aisladas se lleva a cabo en primera instancia para la identificación de género y especie mediante la utilización de la reacción en cadena de la polimerasa con fragmentos de restricción de longitud polimórfica, PCR/RFLP, de las regiones ITS.

Comenzando el análisis de esta manera para las 108 colonias, en uno de los casos se determina una contaminación de seis colonias aisladas en la fase I de la fermentación BOD 5, con lo cual se descartan para continuar su estudio.

De la misma manera se prescinde de la cepa AM1 por que atendiendo a los resultados del análisis molecular no pertenece al género Saccharomyces.

Esto reduce entonces el número de cepas sujetas a estudio a 101. Se verifica pertenencia a la especie Saccharomyces cerevisiae mediante el análisis de de sus regiones ITS, estudiando las 4 bandas típicas obtenidas del fraccionamiento de su amplificado de 880pb mediante el uso de enzimas de restricción.

Posteriormente mediante la utilización del análisis molecular de las regiones Inter-δ se identifican los aislados a nivel de cepa.

El análisis del perfil Inter-δ, permite identificar las diferentes cepas, estudiándose para cada una de ellas el carácter prevalente específico en la fase I y fase II del desarrollo de la fermentación así como su posible prevalencia en ambas fases.

Se observan los casos más significativos de prevalencia, determinando la presencia de una determinada cepa en la Fase I y su dominio sucesivo en la Fase II de fermentación. Se determina esta situación en las fermentaciones BOD1, BOD3 y BOD4, para las cepas AM3, CM4 y I(03)1A3 respectivamente, debido a su identificación predominante en la fase de final de fermentación (Fase II) tal y como se observa en la figura 3.

En el caso de la fermentación identificada como BOD9, la situación de la cepa V1F1B es excepcional, identificándose esta en ambas fases de la fermentación de manera dominante, apareciendo 4 veces en Fase I y 5 veces en Fase II esta cepa (figura 3).

El resumen de los resultados se recoge en la tabla de la Tabla 3, identificando cada una de las cepas encontradas.

La cepa V1F1B, aislada por la Estación Enológica de Navarra (EVENA) de mosto procedente de la variedad tempranillo ha sido posteriormente seleccionada por la Università degli Studi di Modena e Reggio Emilia siguiendo como criterios específicos de selección:

• garantía de prevalencia,
• resistencia al grado alcohólico elevado,
• exigencias nutricionales moderadas,
• optima resistencia a altas temperaturas de fermentación,
• respeto al carácter varietal

Encontrándose actualmente depositada en su colección de cepas como una Saccharomyces cerevisiae r.f. cerevisiae.

2. Estudio de las cinéticas de fermentación y perfil aromático

Los volúmenes de fermentación en las pruebas industriales diseñadas varían según la bodega, encontrándonos con depósitos de 20.000 a 50.000 Kg. de pasta. Las cinéticas de fermentación obtenidas para las 16 fermentaciones industriales inoculadas con la levadura seca activa Fermol Grand Rouge Nature (cepa V1F1B) han mostrado un perfil muy similar como se observa en la gráfica de la figura 4.

Los arranques de fermentación no son extremadamente rápidos y existe una evidente de regularidad fermentación, concluyendo todas las fermentaciones entre los 5 y los 7 días. Las temperaturas se han mantenido en un rango de entre los 20 a los 30 º C durante toda la fermentación para todos los casos salvo las fermentaciones F4 y F9 que han sobrepasado puntualmente la máxima impuesta de los 30 º C, alcanzando los 34 y 32 º C respectivamente.

El análisis de los vinos al descube para cada caso se resume en la tabla 4. La obtención de las medias se realiza con eliminación de los valores extremos.

Se observan diferencias importantes entre el grado probable estimado y el grado alcohólico final alcanzado reflejándose en la media como una diferencia de +0.3 % vol. La media de la acidez volátil se encuentra dentro un valor estimado normal (0.3 g/l), encontrándose valores extremos de 0.43 en caso de F4 y 0.25 en el caso de F1, que también es la fermentación con menor cantidad de azúcares residuales.

Los resultados obtenidos de las curvas de fermentación comparativas para la cepa V1F1B con respecto a la levadura de referencia LEV3 en fermentaciones desarrolladas en 20 000 Kg. pasta homogeneizada en lo posible con el mismo esquema de elaboración propuesto, da como resultados cinéticas de fermentación muy similares.

Tras el descube se muestrean los vinos antes de fermentación maloláctica para el análisis de los compuestos aromáticos. Los cromatogramas obtenidos dan como resultado la identificación de 42 compuestos volátiles, cuantificando por integración de los picos cromatográficos su concentración en las muestras analizadas. Los resultados recogidos en la tabla 5 muestran que existen diferencias significativas en algunos de estos compuestos responsables del aroma. En las figuras siguientes se recogen gráficamente algunas de estas diferencias en función de la escala de concentración en mg/l.

El acetato de isopentilo, hexanoato de etilo y octanoato de etilo son ésteres relacionados con descriptores de aromas afrutados de plátano, el primero y manzana y piña los dos restantes. Son compuestos que se encuentran comúnmente en los vinos tintos como base del aroma, al igual que el ácido isovaleriánico y su éster el isovaleriato de etilo, relacionado con un descriptor de fruta del bosque y mora. El ácido octanoico por su parte se relaciona con un aroma que recuerda la mantequilla rancia.

El succinato de etilo y el lactato de etilo son dos ésteres etílicos relacionados con aromas lácteos y de café. En particular el lactato de etilo contribuye a amortiguar las aristas amargas y ácidas en el gusto y según algunos autores contribuye a enriquecer el volumen y redondez en boca.

Los alcoholes 1-hexenol/ trans-3-hexen-1-ol/ Cis-2-hexen-1-ol y el 2-feniletanol se relacionan con descriptores de recuerdan la hierba y la rosa respectivamente.

Diferencias importantes se encuentran también en el caso del terpeno linalol (floral) y de algunos fenoles volátiles como el 4-etilfenol, que presenta una concentración seis veces superior en el caso de LEV3. Este compuesto se relaciona con olores de tipo animal.

Para evaluar si existen diferencias organolépticas significativas se someten muestras de los vinos al juicio de seis catadores que evalúan en una escala de preferencia 12 descriptores, que deben puntuar de 1 a 5 (menor preferencia a mayor preferencia). El resultado se recoge en el gráfico de la figura 9.

Destaca una mayor valoración de los descriptores relacionados con frutas del boque, frutas rojas y especias en el caso de los vinos fermentados con la cepa V1F1B, mientras que los descriptores de fruta tropical y floral se puntúan más en los vinos de la cepa de referencia LEV3.

Conclusiones

El estudio de la ecología de las fermentaciones espontáneas con caracterización genética mediante análisis molecular ha permitido identificar una variedad importante de cepas indígenas involucradas a priori en el desarrollo del proceso fermentativo. La cualidad de prevalencia de una sola cepa en las fermentaciones espontáneas estudiadas se muestra atípica, siendo lo más común encontrarse con cepas implantadas en una sola o ninguna de las dos fases de fermentación estudiadas.

La identificación y caracterización de la cepa V1F1B como prevalente en el desarrollo de la fermentación espontánea ha generado su selección para el estudio las características fermentativas y su influencia sobre el perfil aromático de los vinos inoculados.

Los resultados relativos a las cinéticas de fermentación muestran que se trata de una cepa que mantiene una evidente regularidad de fermentación en los casos estudiados, concluyendo las fermentaciones entre el 5º y 7º día.

En relación a los resultados comparativos con la levadura de referencia LEV3, aunque cinéticamente no se encuentran diferencias significativas, el análisis de aromas y organoléptico desataca diferencias importantes en el perfil aromático de los vinos fermentados con las distintas cepas. Existe una correlación importante entre los resultados del análisis de los compuestos responsables del aroma con los resultados organolépticos obtenidos evaluando los grupos de descriptores correspondientes.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido desarrollado gracias al aporte material y datos de las distintas bodegas colaboradoras pertenecientes a denominación de origen Rioja así como la labor de los diversos centros de investigación asociados.

Bibliografía

Cacho, J. 2000. Vino y calidad de vida. Innovación y Tecnología. Seminarios de formación. Paraninfo Universidad de Zaragoza.

Guidici, P., Pulvirenti A. Molecular methods for identification of wine yeast. Biodiversity and Biotechnology of wine yeast. Ed. M. Ciani. 2002.

Guillamón, J.M., Sabaté, J., Barrio, E., Querol, A., 1998. Rapid Identification of wine yeast species based on RPLF analysis of the ribosomal ITS region. Arch. Microbiol.,169 , 387- 392.

Hernández-Orte, P. et al. 2005. Influencia de la concentración de aminoácidos del mosto en al aroma del vino obtenido. Sevi nº 3060, 1062-1064.

Hernández-Orte, P., Cacho, J., Ferreira, F. 2002. Relationship between varietal amino acid profile of grapes and wine aromatic composition. Experiments with model solutions and chemometric study. J. of Agric. Food Chem. 50 2891-2899.

López, R. El aroma del vino tinto joven. Caracterización química y métodos de análisis de sus principales odorantes. Tesis doctoral. Universidad de Zaragoza. 1999.

Morata, A et al. 2005. Primeros criterios de selección de levaduras para vinificación en tinto. Sevi nº 3057, 806- 809.

Suárez, J.A., Leal, I., Microbiología enológica. Fundamentos de vinificación. Ed. Mundiprensa. 2004.

Suárez, J.A. Impacto de levaduras y bacterias en los aromas vínicos fermentativos. Comunicaciones Análisis sensorial CS2002 Percepnet. 2002.

Zamora, F. Elaboración y crianza del vino tinto: aspectos científicos y prácticos. AMV ediciones. 2003.

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