En el control de calidad de una bodega el laboratorio enológico está adquiriendo cada día más importancia, sea por la necesidad de obtener cada vez más información sobre las características del vino, sea por las exigencias tanto de la legislación vigente, como de las empresas y los consumidores. Para hacer efectivo este control de calidad existen diferentes métodos de análisis químico que dan respuesta a unas necesidades que podríamos calificar de elementales. Algunos de estos métodos tienen carácter oficial mientras que otros -no oficiales- se hallan muy consolidados en la práctica del sector.

En los últimos tiempos se han planteado diferentes problemáticas relacionadas con la composición del vino (micotoxinas, aminas biógenas, cloroanisoles, fenoles volátiles, etc.). Con toda seguridad, aparecerán otras a día de hoy no predecibles. Estas nuevas necesidades y exigencias precisan metodologías que aún no están establecidas o, al menos, comúnmente aceptadas, entre los especialistas del sector.

En la actualidad, fruto del gran desarrollo de la química analítica, se dispone de gran variedad de instrumentación analítica moderna que se traduce en una aun mayor cantidad de métodos de análisis. El hecho de tener que seleccionar un método de análisis y el correspondiente instrumento analítico es una decisión trascendental que tiene, sin lugar a dudas, gran repercusión en la fiabilidad de los resultados que se pretende obtener, junto con una, quizás no menos importante, incidencia económica.

Por otro lado, hay que tener en cuenta que los enólogos que trabajan en las bodegas no todos poseen la misma formación académica. Unos pertenecen a un ámbito más científico, como los licenciados en enología o en otras ramas de la ciencia (química, biología, farmacia, etc.), otros tienen una formación más tecnológica (ingenieros y tecnólogos de diferentes tipologías), y también hay enólogos que carecen de formación universitaria, pero que poseen amplios conocimientos que han adquirido con la práctica de la profesión vendimia tras vendimia. La formación en química analítica de estos profesionales, a excepción de algunos especialistas, es en muchos casos mínima lo cual, bajo mi punto de vista, hace difícil que puedan obtener, con fiabilidad y seguridad, toda la información química que los instrumentos analíticos ofrecen en estos momentos.

Con el objetivo de facilitar a los enólogos la toma de decisiones en relación a la obtención de información analítica pretendo, junto con mis colaboradores, iniciar una serie de artículos, bajo el título común de “Reflexiones sobre el Análisis Enológico”. En este primero, se presenta una reflexión sobre el “proceso de medida química”, que engloba la sistemática común de todos los métodos de análisis.

Proceso de medida química

El objetivo fundamental de la química analítica cuando se aplica en el ámbito enológico es obtener información química que permita resolver un problema enológico. Para ello existe un proceso sistemático de obtención de esta información, de forma que sea fiable. De forma esquemática este proceso se halla resumido en la figura 1, en la cual se secuencian las diferentes etapas y, de forma más concreta, se destacan las correspondientes al método de análisis propiamente dicho.

En general, estas etapas se pueden encontrar en todos los métodos del análisis enológico, aunque en algunos casos pueda prescindirse de alguna de ellas por ser innecesaria.

1. Definición del problema enológico

El proceso de la medida química se inicia siempre con una concreción clara de cuál es el problema enológico y qué información buscamos. Esta etapa es fundamental ya que condicionará la selección del método a utilizar y, con ello, la fiabilidad de la información obtenida. Al definir el problema debemos tomar en consideración el analito y la matriz del objeto problema, que en nuestro caso normalmente será vino, mosto o uva. El analito es lo que queremos determinar, por ejemplo los azúcares reductores del vino, y debemos tener presente la concentración normal de este analito, que en este caso sabemos que es de alrededor de 1-2 g/l. En relación con la matriz, o sea, el vino, debemos tener en cuenta el resto de compuestos químicos presentes en el mismo, los cuales, en función de método elegido, pueden dar lugar a interferencias en el proceso de medida y, por tanto, resultados sesgados. Evidentemente, el ejemplo de los azúcares reductores es bien conocido, pero planteo a los lectores que definan el problema enológico cuando lo que preocupa son las aminas biógenas, el ácido glucónico o los compuestos fenólicos. Asimismo, cabe destacar que estos últimos podemos querer determinarlos en vino, en mosto o en las pieles de las uvas. Y, evidentemente, en todos los casos estamos planteando problemas muy diferentes.

Al definir el problema debemos decidir con qué exactitud e incertidumbre queremos determinar el analito en cuestión. Parece un contrasentido, pero la exactitud tenemos que decidirla a priori, lo cual no quiere decir que podamos obtenerla. Lo que es evidente es que para obtener resultados muy exactos tendremos que utilizar técnicas de gran sensibilidad y aplicar procedimientos analíticos muy rigurosos, mientras que para obtener resultados menos exactos, o tan solo aproximados, el rigor puede ser mínimo. Por ejemplo, la medida rigurosa del pH requiere emplear un pH-metro que habrá que calibrar previamente con patrones, mientras que una medida aproximada se puede obtener con papel de pH. Ambas medidas son buenas, pero evidentemente la exactitud e incertidumbre son diferentes.

2. Selección del método de análisis

Una vez definido el problema se procede a la selección de la técnica analítica de medida y del método de análisis. Como ya se ha indicado existen muchas técnicas analíticas (espectrofotometría, potenciometría, cromatografía, volumetría, etc.), que se concretan en una gran variedad de instrumentos (colorímetro, espectrofotómetro de absorción atómica, pH-metro, cromatógrafo de gases o de líquidos, etc.). Para resolver un problema concreto pueden ser útiles diferentes técnicas. Por ejemplo, el hierro de un vino puede determinarse por espectrofotometría de absorción atómica o mediante una simple colorimetría. La primera es una técnica muy sensible que requiere emplear un equipo de alto coste, un mantenimiento caro y procedimientos rigurosos, mientras que una colorimetría requiere un equipo de bajo coste, fácil de manipular y una metodología muy simple. La elección de una u otra técnica dependerá de la exactitud e incertidumbre con que queramos determinar nuestro analito.

Una vez seleccionada la técnica se procede a concretar el método de análisis y para ello es necesario proceder a la investigación bibliográfica. En muchos casos, los problemas a resolver son usuales en el sector y la información la encontraremos en los métodos oficiales o en recopilaciones de métodos (muy abundantes en el sector), pero ante problemas nuevos (micotoxinas, aminas biógenas, etc.) habrá que recurrir a revistas científico-técnicas, de las que existen una gran cantidad, ya sea del propio ámbito enológico o del ámbito de los alimentos. También se puede encontrar información en revistas de química analítica. Afortunadamente, en la época actual existen bases de datos especializadas que facilitan mucho esta investigación, pudiendo consultarse con rapidez artículos en los que se detalla la información necesaria sobre la técnica y la metodología adecuadas para determinar nuestro analito en la matriz deseada o en una muy similar. Únicamente habrá que elegir la más adecuada para resolver nuestro problema, que ya tenemos definido, y por descontado acorde con la instrumentación disponible en el laboratorio.

Es muy posible que en este estadio del proceso, el enólogo se cuestione la conveniencia de adquirir un equipo del que no dispone en su laboratorio. E, inmediatamente, se cuestione qué equipo adquirir y con qué prestaciones. Para ello se deben valorar propiedades de las técnicas analíticas tales como sensibilidad, especificidad, límites de detección, etc., que serán el objetivo de un artículo futuro.

3. Toma de muestras

La toma de muestras es una temática bien conocida por los enólogos, ya que es fundamental en el control de la madurez de las uvas. Por ello sólo cabe recordar que es necesario obtener una muestra representativa del problema, es decir que la concentración de nuestro analito en la nuestra sea lo más aproximada posible a la concentración media del mismo en el viñedo, o en el vino del depósito o de las barricas. Además, cabe destacar que la toma de muestras es una de las etapas más crítica del proceso de medida química, ya que es donde normalmente pueden cometerse errores que luego afectarán al resultado analítico.

La toma de muestras requiere un plan de muestreo diseñado de forma estadística, donde se ha de precisar con rigor el número y tamaño, así como la forma (lugar, tiempo, etc.) y las precauciones a tomar para la conservación de las muestras. En el caso de vino la toma de muestras es relativamente simple, ya que el vino es un líquido homogéneo, o fácilmente homogenizable, pero en el caso de las uvas de un viñedo la heterogeneidad es máximo y requiere un plan de muestro riguroso.

4. Preparación de las muestras

Esta etapa es, junto con la toma de muestra, una de las etapas críticas del proceso de la medida química. Normalmente las muestras, ya en el laboratorio, no pueden analizarse directamente, sino que hay que prepararlas para adecuarlas a la técnica y al método a aplicar. Mayoritariamente, las técnicas analíticas requieren muestras líquidas y homogéneas. En el caso del vino y el mosto se debe proceder normalmente a su filtración o centrifugación. En el caso de uvas será necesario proceder a la obtención del mosto y en el caso de las partes sólidas (piel y pepitas) será necesario extraer los analitos de forma que la muestra final sea una muestra líquida representativa.

Una vez disponible la muestra líquida se puede proceder a su análisis, pero aquí aparece el problema de la matriz, es decir del conjunto de compuestos químicos que existen en el vino, mosto, etc. que, en función de la técnica analítica utilizada, pueden dar lugar a interferencias y, con ello, a resultados erróneos. A menos que se utilice una técnica o método específico, se debe proceder a eliminar estas interferencias. Así, por ejemplo, en la determinación de la acidez total del vino se debe eliminar el CO₂ disuelto, ya que al tener carácter ácido (con el agua forma ácido carbónico) interfiere por no estar contemplado como un ácido del vino en la definición de la acidez total. Asimismo, en la determinación de los azúcares reductores, por oxidarse con Cu²⁺ en medio alcalino, es necesario eliminar los compuestos fenólicos ya que son reductores y también reaccionan con el Cu²⁺. En cambio, al determinar los azúcares reductores en forma de glucosa y fructosa por métodos enzimáticos, al ser estos muy específicos, los compuestos fenólicos ya no interfieren, aunque puede ser aconsejable eliminarlos en vinos tintos si tienen mucho color. En todos los casos citados, para eliminar las interferencias se utilizan técnicas de separación. Bajo este nombre se agrupa un gran conjunto de técnicas analíticas, como la destilación, la extracción con disolventes orgánicos, la cromatografía en papel o en columna, la extracción en fase sólida, etc. cuya finalidad es, en todos los casos, la separación de los compuestos interferentes. La importancia de las técnicas de separación en el análisis enológico es evidente si tenemos presente la gran complejidad de la matriz del vino, en la que existen centenares de compuestos químicos que pueden interferir en los resultados.

En la aplicación de algunas de estas técnicas puede ser relativamente fácil proceder a una preconcentración de los analitos de interés. Al aumentar su concentración podemos utilizar técnicas de análisis menos sensibles. Todas las técnicas tienen unos límites de detección y de cuantificación, es decir una concentración por debajo de la cual la técnica no es capaz de efectuar una medida química fiable. En otras palabras, es incapaz de diferenciar una muestra que no contiene el analito de interés (muestra en blanco) de una con concentraciones del analito por debajo del límite de detección.

Muchos de los problemas que se plantean actualmente en el sector enológico se refieren a la determinación de compuestos químicos que se hallan a concentraciones de mg/l (ppm), mg/l (ppb) o ng/l (ppt). Estas concentraciones tan extremadamente bajas se hallan muchas veces por debajo de los límites de detección y cuantificación de las técnicas analíticas y, por esta razón, no pueden ser determinadas directamente, a no ser que se aplique una técnica que permita concentrar los analitos hasta un nivel superior a los citados límites Así, utilizando estas técnicas de separación y preconcentración se pueden determinar actualmente la mayoría de los compuestos del aroma, la presencia de diferentes pesticidas, las aminas biógenas, las micotoxinas, etc.

5. Calibración

Las técnicas analíticas miden normalmente una propiedad química y/o física del analito de interés, propiedad que puede relacionarse con su concentración. Así, en las técnicas volumétricas medimos el volumen de solución valorante que reacciona con el analito y en las técnicas electroanalíticas medimos diferencias de potencial en la medida del pH o tomamos medidas de la conductividad de la solución en las conductimetrías. En los métodos espectrofotométricos se mide la absorción o la emisión de la radiación con un dispositivo detector que nos proporciona una respuesta en forma de una intensidad medida en amperios. Para transformar esta medida instrumental en información química o enológica se procede a la calibración, que es el proceso mediante el que se establece la relación entre la propiedad medida y la concentración del analito.

Todas las técnicas analíticas requieren un proceso de calibración que se efectúa mediante la utilización de un compuesto químico patrón o estándar. De esta forma, en las volumetrías la calibración se efectúa determinando la concentración de la solución valorante empleada para valorar un patrón químico. En este caso, la relación se establece por cálculo matemático ya que los parámetros que intervienen, como la estequiometría de la reacción volumétrica y el peso molecular del analito, son valores constantes. De todas formas, en la mayoría de los métodos instrumentales la relación entre la propiedad medida y la concentración del analito se debe hallar experimentalmente, ya que dicha relación se halla muy influida por las condiciones de trabajo. Por esta razón, la calibración se efectúa preparando una serie de soluciones patrón del analito de las que se mide la propiedad correspondiente en unas condiciones experimentales concretas. Al representar gráficamente estos datos se obtiene una recta de calibrado como la representada en la figura 2. En algunas ocasiones la relación entre la propiedad medida y la concentración no es lineal y se obtiene una curva de calibrado, pero, por comodidad, ésta siempre puede transformarse matemáticamente en una relación lineal.

De la recta de calibrado se pueden obtener diferentes informaciones de gran interés analítico. En primer lugar la sensibilidad de la técnica, expresada por la pendiente de la recta (S=DR/DC), que por definición es la capacidad de la técnica para diferenciar entre concentraciones parecidas o también la capacidad para determinar pequeñas concentraciones del analito. Evidentemente, cuanto mayor sea la pendiente, mayor será la sensibilidad, ya que una misma concentración nos proporcionará mayor respuesta instrumental. Además, se puede observar que al disminuir la concentración, disminuye la respuesta, llegándose a un valor mínimo de concentración por debajo de la cual la respuesta es siempre la misma. Esta concentración es el límite de detección (LD) ya que el instrumento proporciona una respuesta que ya no depende de la concentración. A partir de este dato se puede determinar el límite de cuantificación (LC), que es la concentración mínima que se puede determinar con garantía en cuanto a su exactitud. A partir de este valor, se establece el intervalo lineal que corresponde al rango de concentraciones para las que se ha establecido su relación con la respuesta instrumental y que, por tanto, dará lugar al intervalo de trabajo en el que podemos trabajar cuantitativamente con la técnica. La metodología de calibración antes comentada se conoce como el método del patrón externo y es el más utilizado. No siempre es factible obtener estas rectas de calibrado con este método. A veces la matriz de la muestra puede influir en la respuesta instrumental (efecto matriz) y en este caso se debe utilizar el método de las adiciones estándar, con patrones preparados con la misma muestra a las que se adicionan concentraciones conocidas del analito de interés. En otros casos, la respuesta instrumental es poco reproducible por estar influida por unas condiciones experimentales no controlables totalmente. Para solucionar este problema se puede utilizar el método del patrón interno, en el que se utiliza un segundo compuesto patrón para minimizar la variabilidad de la respuesta. La calibración es una etapa fundamental del procedimiento analítico que merecerá un comentario específico en un artículo futuro.

Finalmente, se debe destacar que una recta de calibrado y las medidas de las muestras deben efectuarse en las mismas condiciones experimentales y que, de forma general, no puede utilizarse una recta de calibrado obtenida en otro momento ya que estas condiciones pueden variar. En todo caso, se deberá verificar la validez de la misma evaluando la respuesta que proporcionan unos patrones de concentración conocida.

6. Medida química

Tras establecer la recta de calibrado se procede a la medida de la propiedad. La respuesta instrumental obtenida se interpola en la recta de calibrado para hallar la concentración. Esto será posible siempre que dicha concentración se halle dentro del intervalo lineal definido en la calibración. Si se halla entre los límites de detección y de cuantificación podremos detectarla, pero no cuantificarla con la exactitud requerida. Si se halla por debajo del límite de detección significa que no podemos detectarla, aunque en ningún caso podremos asegurar que la concentración sea nula, sino que el método utilizado no es suficientemente sensible para determinar la concentración del analito en la muestra. En caso contrario, si la concentración se halla por encima del intervalo lineal establecido nunca podremos extrapolar fuera de este intervalo, sino que tendremos que diluir la muestra y repetir todo el proceso analítico.

7. Evaluación de los resultados

El resultado obtenido no es únicamente un valor, normalmente en forma numérica, sino que lleva asociado una incertidumbre. Esto resulta evidente por el hecho de que al efectuar tres replicados de una misma muestra obtenemos tres resultados más o menos parecidos, pero nunca idénticos. Por ello el resultado se expresa con un valor numérico, obtenido normalmente a partir de la media (x_m) de los resultados, y la incertidumbre, que se calcula a partir de la desviación estándar (s) de los resultados y parámetros estadísticos (t) definidos en función del número de replicados (N). Así se obtiene el intervalo o los límites de confianza.

Este intervalo de confianza nos indica con una probabilidad establecida por el parámetro estadístico t (normalmente un 95%) que el resultado verdadero (m) se halla dentro de él. Lamentablemente, nunca podremos determinar el valor verdadero sino una buena aproximación con más o menos incertidumbre.

A partir del resultado, que expresado por un valor numérico y su incertidumbre ya es la información enológica deseada, los enólogos ya pueden extraer las conclusiones pertinentes.

Frecuentemente al comparar resultados se utilizan los valores sin tener en cuenta la incertidumbre asociada, pudiendo, con ello, cometerse graves errores. Si dos valores diferentes tienen intervalos de confianza que se solapan, hay cierta posibilidad de que realmente no se trate de dos valores diferentes y por ello pueden ser el mismo valor. Es necesario efectuar siempre una evaluación estadística de los resultados para poder extraer conclusiones fiables. Ya trataremos este tema en detalle adelanten el futuro.

Para terminar, al aplicar un método analítico siempre surge la duda de si los resultados obtenidos pueden estar sesgados por un error del método que no controlamos. Para ello existen ensayos interlaboratorios que nos permiten detectar estos posibles errores. Por otra parte, en el laboratorio enológico no se aplican con mucha asiduidad los métodos oficiales, ya que ciertamente algunos son complicados y tediosos en su desarrollo, siendo habitual utilizar métodos desarrollados en el propio laboratorio o métodos usuales en el sector (por ejemplo, la acidez volátil por el método de García-Tena o los diferentes métodos que se utilizan para determinar los azúcares reductores). Estos métodos son, sin lugar a dudas, más cómodos de aplicar, pero se debe verificar si los resultados obtenidos son fiables y comparables a los resultantes de aplicar los métodos oficiales, que, en teoría, poseen mayor exactitud. Esta verificación se realiza mediante una validación del método, siguiendo unos procedimientos perfectamente establecidos. La importancia de este tema hace que, en un futuro cercano y de acuerdo con las recomendaciones de la OIV, todos los métodos utilizados en el laboratorio enológico tendrán que estar validados. Insistiremos sobre este particular en un próximo artículo.

El objetivo del presente artículo ha sido el planteamiento del problema analítico y reflexionar sobre la sistemática del proceso de medida química para obtener resultados que aporten una información fiable. En el futuro se pretende profundizar en todos los temas y conceptos que se han destacado en letras cursivas, ya que son fundamentales para el desarrollo, con la calidad que actualmente se exige, de métodos de análisis en el laboratorio. Muchos de estos temas y conceptos seguramente son bien conocidos por muchos enólogos, pero considero que el planteamiento global del problema analítico, como aquí se ha efectuado, puede ser útil al sector. Ésta ha sido la finalidad de esta reflexión sobre el análisis enológico.

Nota: En los próximos artículos no tenemos intención de incidir sobre métodos de análisis concretos, aunque estamos abiertos a las sugerencias de los lectores. Para ello no tienen más que enviarlas a la dirección de correo electrónico que aparece al inicio del artículo. Además, en la página web del grupo, http://www.quimica.urv.es/w3qaea/, se puede encontrar información sobre métodos de análisis aplicados a la caracterización de los compuestos químicos del vino.

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