En el artículo anterior (1) se reflexionó sobre las técnicas y los instrumentos analíticos necesarios para un laboratorio enológico básico. Ahora procede contestar a la pregunta:

¿Qué métodos deben implantarse en el laboratorio enológico?

De acuerdo con la sistemática del Proceso de Medida Química (2), una vez concretado el problema enológico se debe seleccionar el método a utilizar. Normalmente los problemas que se plantean son muy comunes en el sector, como, por ejemplo, determinar la acidez volátil de un vino o los azúcares de un mosto, y por ello existen diferentes métodos de análisis perfectamente establecidos de uso muy generalizado. Estos métodos son fácilmente localizables, pero, por el contrario, ante problemas nuevos o menos frecuentes, como por ejemplo la determinación de unas pirazinas concretas, no existe una información genérica y es necesario proceder a una búsqueda bibliográfica muy exhaustiva.

En ambos casos el criterio para la selección del método dependerá de los requisitos establecidos en la definición del problema (exactitud y precisión del resultado, tipo de muestra y matriz de la misma, etc.) y las propiedades de los métodos analíticos seleccionables. Cabe recordar que la definición del problema depende fundamentalmente del enólogo, como ya se indicó en su momento (2), mientras que existen diferentes métodos a seleccionar con propiedades analíticas diferentes.

LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS

Un método de análisis se puede definir, de acuerdo con la Resolución OENO 10/2005 (3) de la Oficina Internacional de la Viña y del Vino (OIV), como “el procedimiento escrito que describe el conjunto de los medios y modos operatorios necesarios para efectuar el análisis del analito, esto es: ámbito de aplicación, principio y/o reacciones, definiciones, reactivos, aparatos, modos operatorios, expresión de resultados, precisión e informe de ensayo”. Los métodos de análisis se caracterizan por la exactitud y la precisión de los resultados obtenidos.

En función de la exactitud, que es la propiedad fundamental de un método de análisis, éstos se pueden clasificar en:

• Métodos de referencia: Son métodos validados que permiten obtener el resultado que se acepta como el más exacto. Normalmente están normalizados por organismos competentes (ISO, UNE, AOAC, OIV, etc.) y en muchos casos son métodos oficiales al estar aceptados por organismos gubernamentales (UE, MAPA, EPA, etc.). Normalmente son métodos complicados y lentos por lo que se utilizan principalmente para contrastar la exactitud de otros métodos de análisis más rápidos y de fácil aplicación.




• Métodos de rutina: Son métodos que permiten obtener el resultado con una exactitud menor, pero que son rápidos y fácilmente aplicables. Por ello son los más utilizados en los laboratorios enológicos. La OIV los ha clasificado tradicionalmente como métodos usuales. Su exactitud se determina por validación, normalmente frente a un método de referencia.




• Métodos de cribado: Métodos de análisis muy rápidos, con una exactitud suficiente para poder establecer que el analito está dentro de un intervalo de valores o que está por encima o por debajo de unos límites establecidos. Estos métodos permiten efectuar de forma muy rápida un cribado (screening) de las muestras que cumplen los requisitos establecidos y sólo habrá que analizar con más rigor las muestras dudosas. Equivalen a los métodos rápidos de análisis de la OIV.

Para un analito determinado pueden existir diferentes métodos de referencia junto con una gran cantidad de métodos de rutina y de cribado. En la selección del método deberán tenerse en cuenta, fundamentalmente, sus propiedades analíticas.

Propiedades de los métodos de análisis

Las propiedades más importantes de los métodos de análisis son:

• Exactitud: Puede definirse como el grado de concordancia entre el resultado obtenido y el valor aceptado como verdadero. Las diferencias observadas son el error o sesgo. Esta propiedad está relacionada con la trazabilidad de un resultado.




• Precisión: Puede definirse como el grado de concordancia entre los resultados obtenidos de forma repetitiva en una misma muestra. Si las repeticiones son efectuadas en las mismas condiciones se la conoce como repetibilidad y si las condiciones son diferentes como reproducibilidad. Es una medida de la dispersión de los valores y se expresa en forma de desviación estándar o de varianza. Esta propiedad esta relacionada con la incertidumbre del resultado.




• Sensibilidad: Puede definirse como la capacidad para discriminar entre resultados muy parecidos o, también, como la capacidad para determinar valores muy pequeños. Se obtiene a partir de la relación entre la respuesta analítica y la concentración (calibración). De esta propiedad se derivan los límites de detección y de cuantificación del método. El primero es la concentración mínima de un analito que puede diferenciarse estadísticamente de un ensayo en blanco, mientras que la segunda es la concentración mínima que puede ser determinada con una incertidumbre prefijada.




• Selectividad: Se define como la capacidad de un método para obtener resultados que dependan exclusivamente de la concentración del analito. La selectividad de un método viene condicionada por la presencia de interferencias. La máxima selectividad, sin interferencia alguna, da lugar a métodos específicos.




• Robustez: Se define como la capacidad de un método para aportar resultados poco influenciados por pequeñas variaciones de las condiciones experimentales. Está relacionada con la fiabilidad, que es la capacidad de un método para mantener la exactitud y la precisión a lo largo del tiempo.

Otras propiedades a tener en cuenta son la rapidez del método, los costes, tanto de realización como de infraestructura, y los factores personales (seguridad, comodidad, etc.), que son de gran interés en el control de calidad del laboratorio.

El conocimiento de estas propiedades permite al analista poder tomar decisiones sobre la aplicabilidad de un método de análisis para la resolución del problema planteado y, al mismo tiempo, le permite poder realizarlo con una total confianza en la validez de los resultados que se obtendrán.

Para el conocimiento de estas propiedades se efectúa un proceso de validación del método. Evidentemente todos los métodos a utilizar en el laboratorio han de estar validados, ya que ello nos garantizará la calidad de los resultados.

Validación de los métodos de análisis

Se entiende por validación de un método la caracterización del mismo a partir de la determinación de sus propiedades analíticas principales: Exactitud (trazabilidad), precisión (incertidumbre), selectividad, intervalo de aplicación, linealidad, sensibilidad, límites de detección y de cuantificación, robustez, etc. El proceso de validación de un método consiste en establecer y verificar las prestaciones del método para obtener la información requerida y la veracidad de esta información.

En este proceso podemos destacar tres apartados principales, cada uno de ellos con unos objetivos y unas herramientas adecuadas para la validación (Tabla 1):

1. Campos de aplicación del método: En este apartado se definen las matrices analizables con el método. En el caso de muestras enológicas se deberá concretar si el método es aplicable a todo tipo de vinos (blancos, tintos, dulces, espumosos, generosos, etc.) o solo a alguno en particular. Además se ha de concretar el intervalo de valores analizables con el método. Un método para determinar el grado alcohólico aplicable a vinos con 10-15 %vol es muy interesante, pero un método aplicable únicamente a vinos entre 10-10,5 %vol puede que ya no lo sea tanto.

También se debe establecer los límites de detección y cuantificación, aunque no es necesario en el caso de analitos o parámetros cuyo valor inferior no tiende a cero (por ejemplo, grado alcohólico, pH, acidez total, etc.). Así mismo se establece la robustez del método.

2. Evaluación del error sistemático: Los errores sistemáticos, también llamado errores determinados, son los que resultan de alteraciones operacionales concretas del procedimiento analítico. Por ejemplo, un instrumento mal calibrado, una pesada incorrecta, un enrase mal efectuado, un reactivo deteriorado, una filtración incompleta, etc. En otras palabras, una operación mal efectuada y por ello estos errores son evitables. La solución es hacerlo bien, de acuerdo con las buenas prácticas de laboratorio (BPL). Estos errores, que pueden ser positivos o negativos, son importantes ya que inciden directamente en el resultado y afectan a la exactitud del mismo.

El objetivo inicial es concretar la linealidad del método, es decir, establecer el intervalo de concentraciones en el que hay una relación lineal entre la respuesta y la concentración. En otras palabras, se obtiene una recta de calibrado con una serie de patrones con concentraciones superiores al límite de cuantificación y se verifica su linealidad. Si es lineal, su pendiente será la sensibilidad del método. La especificidad del método se establece verificando la influencia de posibles compuestos interferentes.

Finalmente se verifica la exactitud del método y para ello es necesario disponer de valores de referencia. Éstos se obtienen fundamentalmente a partir de materiales de referencia (MR) o de métodos de referencia. Los primeros son materiales o sustancias que tienen perfectamente establecidos los valores de algunos de sus parámetros de concentración y que se usan principalmente para la evaluación de métodos de análisis. Existen materiales de referencia certificados (MCR) en los que las concentraciones se han establecido bajo la responsabilidad de organismos competentes (NIST, BCR, etc.). La evaluación de la exactitud del método se efectúa aplicándolo al MR y comparando el valor obtenido con el aceptado para el MR. En el caso de existir un método de referencia se aplican el método de estudio y el de referencia a una misma muestra (o serie de muestras) y se comparan los resultados.

Los ejercicios interlaboratorios son aquellos en los que diferentes laboratorios se organizan para realizar de forma independiente una serie de análisis de unas mismas muestras. El objetivo de este ejercicio es múltiple: a) Validación del método utilizado (ejercicios colaborativos), b) Certificación de los valores y sus incertidumbres, de los materiales de referencia y c) Evaluación de la calidad de los resultados obtenidos por un laboratorio (pruebas de aptitud o pericia). Por ello la participación en estos ejercicios puede ser un excelente procedimiento para evaluar la exactitud de un método en estudio.

De todas formas lo más usual es utilizar materiales de referencia. Afortunadamente, para verificar la exactitud de los métodos de análisis utilizados en el laboratorio enológico existen en el mercado dos series de materiales de referencia específicos para el análisis enológico:

• TITRIVIN (Materiales de referencia de la “Chambre d’Agriculture de la Gironde”): Son diferentes mezclas estabilizadas de vino y mosto, cuyos valores de referencia se han establecido en un ejercicio interlaboratorio en el que han participado al menos 15 laboratorios enológicos acreditados que han utilizado los métodos oficiales. Los parámetros analizados son los de mayor interés en el sector, como grado alcohólico, acidez total y volátil, pH, ácidos málico, láctico, glucosa, fructosa, azúcares reductores, IPT, hierro, cobre, potasio, calcio, etc.) aportando tanto el valor de referencia como su incertidumbre expresada en forma de intervalo de confianza.




• Materiales de referencia del “Centre d’Œnologie de Bourgogne”: Soluciones cuyos valores de referencia, y su incertidumbre, han sido determinados por un número indeterminado de laboratorios utilizando métodos reconocidos. Los valores explicitados son los anteriores, aunque incluyen el glicerol y los ácidos tartárico y cítrico.



3. Evaluación del error aleatorio: En esta etapa se evalúa la precisión del método a partir del estudio de la repetibilidad y de la reproducibilidad intralaboratorio.

Los métodos de análisis enológico

El laboratorio enológico básico está pensado para resolver los problemas enológicos muy tipificados y por ello la información sobre los métodos a utilizar se puede hallar fácilmente al estar recopilados en libros y manuales especializados.

Las referencias bibliográficas principales son los Métodos Internacionales de Análisis de la Organización Internacional de la Viña y del Vino (OIV) (4) y los Métodos Oficiales de Análisis de la Unión Europea (5,6), junto con los Métodos Oficiales de Análisis de la AOAC International (7).

Los métodos de la OIV no son métodos oficiales, aunque la mayoría de ellos han sido adoptados por la Unión Europea como métodos oficiales. Tanto unos como otros son los más utilizados en los laboratorios enológicos europeos.

Los métodos de la AOAC Internacional son muy utilizados en los países de tradición anglosajona. La AOAC Internacional se creó a finales del siglo XIX como Asociación de Químicos Agrícolas para transformarse posteriormente en Asociación de Químicos Analíticos. Por ello entre sus métodos oficiales existen muchos aplicados a productos vitivinícolas o relacionados y su consulta puede ser de un gran interés para la selección del método a implementar en el laboratorio.

Evidentemente, los métodos oficiales son el recurso obligado en el caso de litigios, pero normalmente son laboriosos y complicados de desarrollar, por lo que en los laboratorios enológicos se utilizan métodos más simples y rápidos, ya sea por simplificación del procedimiento del método oficial o por el uso de un método alternativo desarrollado en el propio laboratorio.

Por ello en el sector coexisten dos tipos de métodos de análisis: los métodos oficiales y los métodos no oficiales. Los métodos oficiales son métodos de referencia por lo que, en principio, son métodos validados y nos aportan un resultado aceptado como exacto. Los métodos más modernos de la OIV cumplen con este requisito y se conocen los parámetros de su validación.

Por su mayor rapidez y simplicidad los métodos más utilizados son los no oficiales y, en principio, estos métodos no han sido validados. Entre estos métodos no oficiales tenemos algunos muy importantes, como la determinación del grado alcohólico por ebullometría, la determinación de la acidez volátil por el método de García-Tena, la determinación de los azúcares reductores por el método de Rebelein o el índice de polifenoles totales (IPT). Aunque no estén validados, estos métodos deben seguir utilizándose ya que por su simplicidad nos aportan de una forma relativamente rápida una información analítica de gran interés, cuyo único defecto es que no estamos seguros de su exactitud y precisión. Pero esto puede solucionarse con la validación de los estos métodos.

Mientras que los métodos oficiales son fácilmente localizables en la bibliografía especializada (4-7), los métodos no oficiales son más difíciles de localizar. Con todo existen algunas referencias destacables, unas por aportar las metodologías de estos métodos no oficiales (8-11) y otras por aportar, además, información sobre el fundamento de estos métodos (12-13).

Recomendaciones finales

Una vez se tiene conocimiento de los tipos de métodos de análisis y de sus características y propiedades analíticas y se dispone de la adecuada bibliografía sobre los posibles métodos a aplicar, pueden aparecer dos cuestiones finales:

1. ¿Qué método de análisis se debe utilizar en el laboratorio enológico?

La respuesta a esta cuestión es muy simple: El que se quiera, siempre que cumpla con los requisitos establecidos a priori al definir el problema. Tras establecer con qué exactitud y precisión se quiere obtener el resultado analítico, solamente hay que escoger el método de análisis que nos los garantice. Tanto da que sea un método oficial o como que no lo sea. En principio si es un método oficial será el más exacto. Y si es un método no oficial deberá estar validado y con ello conoceremos sus prestaciones.

En este momento cabe destacar que es muy importante al seleccionar un método hay que tener muy presente su adecuación al propósito (fitness-for-purpose), que no es más que el grado de ajuste entre las características de los datos obtenidos y las necesidades establecidas al concretar el problema. De forma ideal deberíamos escoger un método que nos aporte unos resultados con la exactitud y precisión suficiente para poder sacar una conclusión correcta. Y si el método es rápido, simple y barato, mejor.

2. ¿Cómo se puede estar seguro de que se trabaja bien en la aplicación de un método de análisis?

Una vez se tiene el método de análisis implementado en el laboratorio pueden surgir dudas sobre la correcta aplicación del mismo y si los valores que nos aporta tienen la exactitud y precisión previstas en la validación previa. Cabe recordar que la precisión viene afectada únicamente por errores aleatorios, pero podemos cometer errores sistemáticos que afectan a la exactitud del método.

Existen dos posibles respuestas. La primera y mejor es la evaluación externa con la participación en ejercicios interlaboratorios que se programan con el objeto de evaluar la aptitud de los laboratorios (pruebas de aptitud o pericia, proficiency testing). En estos ejercicios los laboratorios participantes analizan unos mismos materiales de referencia y la comparación de los resultados obtenidos permite evaluar la exactitud y precisión de los métodos utilizados. Y con ello también se puede evaluar su correcta aplicación.

La segunda respuesta es una evaluación interna, por lo que de entrada es más fácil. Ésta consiste en analizar unos materiales de referencia con el método a ensayar. En el caso de no disponer de materiales de referencia se pueden preparar internamente a partir de unas muestras, en nuestro caso mostos o vinos, a los que se les adiciona cantidades conocidas del compuesto a determinar (adiciones estándar). La muestra original y las muestras adicionadas se analizan y se verifica la recuperación de la cantidad de compuesto adicionado.

En un laboratorio enológico básico unas recuperaciones superiores al 90% pueden ser consideradas como aceptables (13) en los análisis que usualmente se realizan.

Bibliografía

1. J. Guasch. El laboratorio enológico (I). Enólogos, 41, 30-33 (2006).
2. J. Guasch. El proceso de la medida química. Enólogos, 40, 56-59 (2006).
3. OIV. Guía práctica para la validación, el control de calidad y la estimación de la incertidumbre de un método de análisis enológico alternativo. Resolución OENO 10/2005. (www.oiv.int).
4. OIV. Recueil des méthodes internationales d'analyse des vins et des moûts. Organisation Internationale de la Vigne et du Vin, París, 2005. (www.oiv.int).
5. Reglamento (CEE) No.2676/90 de la Comisión, de 17 de septiembre de 1990, por el que se determinan los métodos de análisis comunitarios aplicables en el sector del vino. Diario Oficial No. L272 de 03/10/1990, p.1–192.
6. Métodos oficiales de análisis en la Unión Europea. Diario oficial de las Comunidades Europeas. Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación. Madrid, 1998.
7. W. Horwitz (ed). Official Methods of Analysis of AOAC International (18th ed). AOAC International, Gaithersburg (USA), 2005.
8. J. García Barceló. Técnicas analíticas para vinos. GAB, Moja-Olèrdola, 1990.
9. J. García Barceló. Metodología de análisis de vinos y derivados. SEPSA, Vilafranca del Penedès, 1976.
10. W. Zoecklein, K.C. Fuselsang, B.H. Gump, F.S. Nury. Wine Analysis and Production. Chapman & Hall, 1995.
11. C.S. Ough, M.A. Amerine. Methods for Analysis of Must and Wines (2nd ed). Wiley, 1988.
12. J. Blouin. Techniques d’analyses des moûts et des vins. Dujardin-Salleron, París (1992).
13. P. Iland, N. Bruer. G. Edwards, S. Weeks, E. Wilkes. Chemical analysis of grapes and wine: techniques and concepts. Patrick Iland Wine Promotions, Campbelltown (2004).
14. J.L. Jacobson. Introduction to wine laboratory practices and procedures. Springer, 2006.

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