RESUMEN

La determinación del 2,4,6-tricloroanisol (TCA) transferible es el procedimiento usual que se utiliza en el control de calidad de los tapones de corcho. Recientemente AENOR ha publicado la norma UNE 56930:2005, en la cual se detalla la determinación analítica del TCA transferible. Esta norma propone la extracción del TCA mediante la maceración del corcho en una solución hidroalcohólica, y una posterior separación y concentración del TCA mediante la microextracción en fase sólida (SPME). La cuantificación final del TCA se lleva a cabo mediante cromatografía de gases, ya sea con detector de espectrometría de masas o de captura electrónica.

Sin embargo, la norma no concreta de forma explícita el valor de las variables experimentales del ensayo, estableciendo unos amplios intervalos de tiempo y temperatura para la maceración inicial del corcho y para la posterior extracción por SPME. Por ello se ha creído necesario llevar a cabo un estudio de estas variables experimentales, dentro de los intervalos especificados por la norma, para comprobar cómo afectan en la determinación del TCA transferible. Los resultados del estudio efectuado demuestran la importancia de utilizar unas condiciones experimentales estrictas para la obtención de resultados fiables y reproducibles.

INTRODUCCIÓN

El vino debe estar libre de todo defecto organoléptico y por ello el sistema de control de calidad de las bodegas tiene que ser capaz de detectar estas posibles alteraciones antes de que el producto sea puesto en el mercado. Por su gran repercusión económica, uno de los defectos más importantes es el llamado sabor a corcho, aunque la denominación sabor a humedad sea más correcta [1]. El principal responsable de transferir al vino este desagradable aroma de cartón mojado o humedad es el 2,4,6-tricloroanisol (TCA) [2], aunque otros compuestos se ven también involucrados [3]. La aparición de los cloroanisoles puede ser debido a varias causas, aunque la principal vía de formación es a partir de los clorofenoles, a través de una O-metilación mediada por microorganismos, especialmente hongos, a ciertas condiciones de temperatura y humedad [4-5].

El origen del TCA en el vino es controvertido, aunque es evidente que si está presente en el corcho puede migrar al vino [6-7]. De todas formas ésta no es la única causa de aparición de este defecto, ya que vinos que nunca han estado en contacto con corcho pueden presentar este defecto [8]. La proporción de TCA que pasa del tapón al vino es muy variable, ya que depende de muchos factores [7]. Pero, a pesar de esto, el control de calidad de corcho se fundamenta en esta migración, macerando el tapón de corcho y analizando el TCA transferido al macerante [9].

El límite de percepción sensorial del TCA en vinos varía, normalmente entre 1-50 ng/l [10-14]. La cuantificación de este compuesto a tan baja concentración ha supuesto un reto analítico importante. La cromatografía de gases (GC), ya sea con detector de captura electrónica (ECD) [14-16] o de espectrometría de masas (MSD) [17-18], se ha presentado como la técnica analítica más utilizada. Pero la GC no es suficientemente sensible para detectar estos extremadamente bajos niveles de concentración, siendo necesaria la aplicación previa de una técnica de extracción y concentración. La microextracción en fase sólida (SPME) [14, 19] se presenta como la idónea para realizar esta etapa previa, ya que realiza la extracción y concentración de los compuestos sobre un fibra de pequeñas dimensiones en un solo paso, no requiere la adición de ningún solvente orgánico, es fácilmente automatizable y es moderadamente económica. La extracción mediante esta técnica se puede realizar de manera directa, es decir, por inmersión de la fibra en la muestra a analizar o mediante análisis del espacio de cabeza o headspace (HS) [14, 19]. Esta última es la modalidad normalmente aplicada en este tipo de análisis, presentando, como grandes ventajas, una menor influencia de la matriz, una mejor selectividad y sensibilidad.

Recientemente AENOR ha publicado la norma UNE 56930:2005 [9], proponiendo un método para la determinación del TCA transferible. Éste se basa en una maceración del tapón de corcho en una solución hidroalcohólica al 12 %. Posteriormente se lleva a cabo una extracción del TCA presente en la solución macerante por SPME utilizando una fibra de polidimetilsiloxano (PDMS). Finalmente, el extracto retenido sobre la fibra es inyectado directamente en el GC. La cuantificación se lleva a cabo a partir de una recta de calibrado construida previamente con patrones de concentración conocida y mediante la técnica del patrón interno.

El método propuesto por la norma no concreta el valor de las variables experimentales, sino que propone unos amplios intervalos: 20ºC ± 2ºC para la temperatura de maceración, 20 horas ± 4 horas para el tiempo de maceración y entre 15 minutos y 30 minutos respecto el tiempo de extracción con SPME. El único parámetro del cual se concreta su valor es la temperatura de extracción: 35ºC. Dada la importancia de estas variables experimentales en el resultado analítico se ha considerado necesario estudiar su influencia para poder asegurar la fiabilidad y representatividad de este método analítico.

Otro aspecto a tener en cuenta es que la norma UNE 56930:2005 no precisa los parámetros de calidad del método ya que no especifica ni la repetibilidad, ni las recuperaciones, ni los límites de detección y cuantificación. Estos parámetros son imprescindibles cuando se presenta un método ya que son los que garantizan que la aplicación del mismo, dentro de unos intervalos concretos, proporcionará resultados fiables y representativos [20]. A título de ejemplo, a continuación se presentan los parámetros de calidad de un método desarrollado en nuestro laboratorio, el cual permite cuantificar el TCA en vino, ya sea tinto, rosado o blanco. Este método es aplicable en el rango de concentraciones de 1,0 ng/l y 100,0 ng/l. La recta de calibrado, construida con vino sintético, presenta un coeficiente de correlación de 0,994. El límite de detección y cuantificación son 0,3 ng/l y 1,0 ng/l, respectivamente. La repetibilidad y precisión intermedia son 10,1% y 11,4%, respectivamente. Finalmente, las recuperaciones del método son de alrededor el 100%, en todos los niveles de concentración.

La falta de concreción en la descripción del método propuesto por AENOR hizo que nuestro grupo de investigación decidiera comprobar el efecto de las variables experimentales dentro de los intervalos de trabajo propuestos por la norma para evaluar su influencia en el resultado final, es decir, en la concentración del TCA transferible.

MATERIALES Y MÉTODOS

Maceración del corcho: De acuerdo con la norma UNE 56930:2005, se ha efectuado en una solución hidroalcohólica al 12 %. Se ha utilizado etanol de calidad HPLC.

SPME: De acuerdo con la norma UNE 56930:2005 se ha utilizado una fibra recubierta de polidimetilsiloxano (PDMS) de 100 mm.

Calibración del método: Para la construcción de la recta de calibrado se ha utilizado la técnica del patrón interno utilizando el 2,3,6-triclorotolueno (TCT). Para ello se prepararon distintas disoluciones de 2,4,6-tricloroanisol (TCA) en una mezcla hidroalcohólica al 12%, de concentraciones entre 1,0-50,0 ng/l con una concentración constante de TCT de 75 ng/l. Concretamente, se han preparado 7 niveles de concentración de TCA dentro del rango especificado y se llevaron a cabo análisis por triplicado de cada solución patrón.

Condiciones cromatográficas: Dado que la norma no especifica éstas, se optó por utilizar las correspondientes al método desarrollado en nuestro laboratorio y comentado anteriormente. Así pues, todos los análisis se realizaron en un cromatógrafo de gases (GC) Hewlett-Packard 5890 series II equipado con un detector de captura electrónica (ECD) de la misma casa comercial. Se ha utilizado una columna de polietilenglicol Chrompack CP-Wax 57 CB (50 m x 0,25 mm I.D., 0,20 mm). Como gas portador se ha utilizado helio de alta pureza (0,8 ml/min). La rampa de temperaturas fue: 40ºC (2 min), 13ºC/min hasta 150ºC (10 min), 15ºC/min hasta 220ºC. La temperatura del inyector fue de 250ºC y la del detector de 300ºC.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

De acuerdo con la norma UNE 56930:2005 [9] se construyó una recta de calibrado, la cual proporcionó un coeficiente de correlación de 0,994.

El paso siguiente fue proceder al estudio de las tres variables experimentales que se pretendían evaluar: tiempo y temperatura de maceración y tiempo de extracción con SPME. Para llevar a cabo el estudio del efecto de estos parámetros sobre el resultado final, existen diferentes alternativas. Una de ellas es el método clásico de variar el valor de una de las variables mientras se mantiene constante el valor de las demás, y así sucesivamente. El principal problema de esta manera de trabajar es la necesidad de realizar muchos experimentos para estudiar todas las variables, implicando mucho tiempo de experimentación. Sin embargo, existe otra alternativa, llamada diseño experimental, que nos permite estudiar todas estas variables al mismo tiempo en un intervalo de valores predeterminado, mediante la utilización de un número mínimo de experimentos [20].

En el estudio realizado se ha utilizado el diseño experimental denominado factorial completo, el cual ya había sido utilizado con éxito en nuestro laboratorio [14]. Este tipo de diseño de experimentos permite determinar qué variables experimentales (factores), y cuáles de las interacciones entre ellas, influyen en la respuesta analítica. También nos permite valorar estadísticamente la influencia de cada variable [20].

En el diseño experimental se han estudiado tres variables: La temperatura de maceración (A), el tiempo de maceración (B) y el tiempo de extracción con SPME (C). El número de experimentos a realizar es 2 elevado al número de factores (en este caso 3), es decir, 8 experimentos. En la tabla 1 aparece la matriz de experimentos así como su traducción a lo que sería el plan de experimentación para este caso concreto. Se entiende como matriz de experimentos la representación de los experimentos a realizar, mediante la codificación (+) y (-). La denominación (+) corresponde al valor máximo del factor (variable) considerado y la denominación (-) al valor mínimo. En las filas se representan los experimentos a realizar y en las columnas los factores. Si sustituimos los signos (+) y (–) por los valores experimentales concretos de cada factor obtenemos el plan de experimentación. Al utilizar esta estrategia es importante llevar a cabo duplicados, como mínimo, de cada análisis. De esta manera se puede determinar la influencia de cada variable a partir de la desviación estándar de las respuestas y calcular su límite de confianza. Mediante este último se podrá determinar si el factor tiene o no una influencia en los resultados, es decir, evaluar si su influencia es estadísticamente significativa y si su variabilidad no se debe solamente al error experimental. Otra manera de decirlo es que si el valor de las variables está dentro del límite de confianza, su efecto no es mayor que el error experimental, de manera que no puede decirse que tenga influencia en el resultado [20].

Tabla 1. Matriz de experimentos y plan de experimentación para estudiar el efecto de los tres factores a evaluar: A: temperatura de maceración, B: tiempo de maceración, C: tiempo de extracción con SPME.

Una vez identificados los experimentos a realizar, había que resolver el problema de las muestras. Para poder llegar a resultados concluyentes era necesario disponer de 8 muestras de corcho idénticas, es decir, con la misma cantidad de TCA en ellas, para poder realizar los 8 experimentos. La obtención de estas muestras era imprescindible para asegurar que las diferencias entre los experimentos no eran causadas por la diferencia de concentración del TCA entre los diferentes tapones. Pero la obtención de estas muestras era totalmente imposible, ya que no existen tapones idénticos. Así pues, para solventar este problema se escogieron 8 tapones de los que se sabía que contenían TCA. Cada uno fue cortado en 8 partes iguales. Se escogió, al azar, una parte de cada corcho de manera que se obtuvieron 8 nuevas muestras constituidas, cada una de ellas, por 8 trozos de corcho.

Para la maceración, la norma [9] propone el uso de un frasco con cierre, de 100 ml, de material inerte, inodoro e insípido. El tapón de corcho debe ser introducido dentro del recipiente y llenarlo completamente con la solución macerante, asegurando no dejar ninguna cámara de aire. Sin embargo, desde un punto de vista experimental, este modo de trabajar puede afectar al resultado final ya que, dependiendo del volumen del corcho, el volumen de la solución macerante será distinto. Por ello, para realizar el estudio se utilizó exactamente 100 ml de solución macerante y nos cercioramos de que los tapones quedaban totalmente sumergidos. De esta manera, controlando el volumen de solución macerante y conociendo el peso exacto de cada muestra, era posible conocer la cantidad de TCA transferible respecto a la cantidad de corcho con el que se había llevado a cabo la maceración.

En la tabla 2 aparecen los resultados obtenidos al realizar los experimentos antes descritos.

Tal y como puede comprobarse en la tabla 2, el TCA transferible depende de las condiciones experimentales. Así pues, si comparamos los experimentos realizados en las condiciones extremas (experimentos 1 y 8), podemos ver que mientras en el experimento 1 se obtiene un TCA transferible de 40,1 ng/l, en el experimento 8 sólo se obtiene un 25,1 ng/l, lo que representa una diferencia del 62% respecto al valor máximo. Por lo tanto, queda patente que el valor de las variables estudiadas (factores) tiene un claro efecto sobre el resultado final.

Para ver el efecto de cada una de estas variables se ha representado gráficamente (Figura 1). En este gráfico se puede observar que en el eje de ordenadas se representa cada una de las variables estudiadas y en el eje de abcisas se representa la magnitud de esta variable. Mediante una línea vertical discontinua se representa el intervalo de confianza, de manera que las variables que tengan una magnitud superior al intervalo de confianza se podrán considerar influyentes en la obtención del TCA transferible, ya que, como se ha comentado anteriormente, en este caso la variación no puede atribuirse solamente al error experimental del método. De esta manera se deduce que los factores que tienen una influencia directa en el TCA transferible (Figura 1.a) son el tiempo y la temperatura de maceración, así como la interacción simultanea de las tres variables estudiadas. Estos factores presentan un valor superior al límite de confianza - establecido en ± 2,82, para un nivel de confianza del 95%-. Concretamente, la temperatura y el tiempo de maceración tienen un efecto positivo (su respuesta es positiva), es decir, al incrementar sus valores se obtienen mejores resultados de extracción de TCA. Sin embargo, a partir del gráfico se puede deducir también que el tiempo de extracción de la SPME no influye. Así pues, parece que al aumentar el tiempo y la temperatura de maceración, aumenta la migración de TCA desde el corcho a la solución hidroalcohólica. El aumento del tiempo de extracción mediante SPME no produce un incremento en la cuantificación del TCA. Esto puede ser debido a que ya se ha llegado a un equilibrio en la extracción.

Respecto a los valores de TCA transferible referidos al peso de corcho (Figura 1.b) se puede verificar que el tiempo de maceración y la interacción de los tres factores conjuntos influyen en la respuesta, ya que sólo estos tienen una magnitud superior al límite de confianza - establecido en ±43,3, para un nivel de confianza del 95%-. Por ello deben ser considerados estadísticamente significativos. Es importante destacar que cuando se refiere el TCA transferible a la cantidad de corcho, la influencia de la temperatura de maceración no es estadísticamente significativa.

Así pues, el estudio realizado y aquí presentado demuestra la importancia de controlar los parámetros utilizados durante la maceración del corcho con el objetivo de determinar el TCA transferible. A partir de los resultados obtenidos queda patente que la norma UNE 56930:2005 tendría que presentar unos parámetros más concretos con el objetivo de obtener valores de TCA transferible representativos y comparables.

Figura 1. Cuadros Pareto que muestran los efectos de la maceración del corcho con solución hidroalcohólica y posterior extracción cuantificación con HS-SPME-GC-ECD. 1.a) Efecto de los factores al referir la concentración de TCA a la solución hidroalcohólica. 1.b) Efecto de los factores al referir la concentración de TCA a la cantidad de corcho. (A) temperatura de maceración, (B) tiempo de maceración, (C) tiempo de extracción con SPME; y la interacción entre ellos. El intervalo de confianza aparece representado por un línea (α = 0,05 y 8 grados de libertad).

CONCLUSIONES

Los resultados obtenidos en este estudio nos demuestran la importancia de controlar los distintos parámetros experimentales en la determinación del TCA transferible ya que, dependiendo de este valor, el resultado final puede variar considerablemente (hasta un 62%). Concretamente hay que controlar el tiempo y temperatura de maceración, ya que condicionan la extracción del TCA en el proceso de la maceración con el solvente. Además, también es importante controlar el volumen del macerante y registrar el peso del corcho para proporcionar valores de concentración exactos del TCA transferible. De los resultados obtenidos se puede extraer que las condiciones óptimas para determinar el TCA transferible, dentro de los intervalos estudiados, son: 22ºC y 24 horas de maceración. Con estas condiciones se obtienen las concentraciones de TCA transferible más altas.

Los autores de este trabajo agradecen la colaboración de Marie Manon Herrero por su participación en la parte experimental del trabajo.

BIBLIOGRAFÍA

[1] Silva, C.; Figueiredo, J. J.; San Romao, M. V. (2000) Cork taint in wine: Scientific knowledge and public perception – a critical review. Crit. Rev. Microbiol., 26 (3), 147-162.

[2] Buser, H. R.; Zanier, C.; Tanner, H. (1982) Identification of 2,4,6-trichloroanisole as a potent compound causing cork taint in wine. J. Agric. Food Chem., 30, 359-362.

[3] Lee, T.H. Simpson, R. Microbiology and chemistry of cork taints in wine, en Fleet, G. H (editor) Wine microbiology and biotechnology. (1992) Ed. Harwood Academic Publishers. Chur (Suiza).

[4] Álvarez, M. L.; López, L.; López, J. M.; Rodríguez, E.; Martínez, M. J.; Larriba, G.; Coque, J. J. R. (2002) Cork taint of wines: Role of the Filamentous fungi isolated from cork in the formation of 2,4,6-trichloroanisole by O-methylation of 2,4,6-trichlorophenol. Appl. Environ. Microbiol., 68 (12), 5860-5869.

[5] Navascués, E.; Calderón, F.; Suárez, J. A. (2001) El metabolisme microbià en el binomi suro-vi. ACE Revista d’Enologia, 18, 8-11.

[6] Capone, D.L.; Skouroumounis, G. K.; Sefton, M. A. (2002) Permeation of 2,4,6-trichloroanisole through cork closures in wine bottles. Aust. J. Grape W. Res., 8 (3), 106-109.

[7] Juanola, R.; Subirà, D.; Salvadó, V.; García, J. A. (2005) Migration of 2,4,6-trichloroanisole from cork stoppers to wine. Eur. Food Res. Technol., 220, 347-352.

[8] Hermosín, I.; Peña, A. I. (2002) Los tapones para botellas de vino: eficacia de cierre, control de calidad sensorial y microbiológica, y relación con el defecto de “gusto a corcho” del vino. Tecnología del vino, 4, 64-78.

[9] AENOR (2005). UNE 56930. Determinación del 2,4,6-tricloroanisol (TCA) transferible.

[10] Fisher, C.; Fischer, U. (1997) Analysis of cork taint in wine and cork at olfactory subthreshold levels by solid phase microextraction. J. Agric. Food Chem., 45, 1995-1997.

[11] Gómez, J. L.; García, T.; Lorenzo, F.; González, A. G. (2005) Optimisation of a pressurised liquid extraction method for haloanisoles in cork stoppers. Anal. Chim. Acta, 540, 17-24.

[12] Martí, M. P.; Boqué, R.; Riu, M.; Busto, O.; Guasch, J. (2003) Fast screening method for determining 2,4,6-trichloroanisole in wines using a headspace-mass spectrometry (HS-MS) system and multivariate calibration. Anal. Bioanal. Chem., 376, 497-501.

[13] Prescott, J.; Norris, L.; Kunst, M.; Kim, S. (2005) Estimating a ”consumer rejection threshold” for cork taint in white wine. Food Quality and Preference, 16, 345-349.

[14] Riu, M.; Mestres, M.; Busto, O.; Guasch, J. (2002) Determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography-electron-capture detection. J. Chromatograph. A, 977, 1-8.

[15] Martínez, A.; González, J. M.; Pizarro, C. (2004) Optimisation of a headspace solid-phase microextraction method for the direct determination of chloroanisoles related to cork taint in red wine. J. Chromatograph. A, 1056, 49-56.

[16] Alzaga, R.; Ortiz, L.; Sánchez, F.; Marco, M. P.; Bayona, J. (2003) accurate determination of 2,4,6-trichloroanisole in wines at low parts per trillion by solid-phase microextraction followed by GC-ECD. J. Agric. Food Chem., 51, 3509-3514.

[17] Insa, S.; Anticó, E.; Ferreira, V. (2005) Highly selective solid-phase extraction and large volume injection for the robust gas chromatography-mass spectrometric análisis of TCA and TBA in wines. J. Chromatograph. A, 1089, 235-242.

[18] Evans, T. J.; Butzke, C. E.; Ebeler, S. E. (1997) Analysis of 2,4,6-trichloroanisole in wines using solid-phase microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry. J. Chromatograph. A, 786, 293-298.

[19] Pawliszyn, J. Solid Phase Microextraction (1997) Ed. Wiley-VCH, Inc. Ney York (USA).

[20] Massart, D. L.; Vandeginste, B. G. M.; Buydens, L. M. C.; De Jong, S.; Lewi, P. J.; Smeyers-Verbeke, en Vandeginste, B. G. M. Ruton, S. C. (editores) Handbook of Chemometrics and Qualimetrics: Part A (Volumen 20A) en Data Handling in Science and Technology (1997) Ed. Elsevier Science B. V. Amsterdam (Holanda).

DESCARGAR ARTICULO (formato word). 22 kb.

VOLVER