SUMARIO:

Como continuación del proyecto de investigación aprobado por la UNLa, se procedió a preparar, a escala piloto, vinos tintos y blancos usando diferentes cepas de levadura del mercado local. Simultáneamente se controló una serie de parámetros analíticos y especialmente el aminograma presente en las uvas, mostos y vino producidos usando rp-plc con detección fluorescente. Se observó que Prolina es el aminoácido predominante en todo el proceso de la vinificación, siguiendo, mucho menor concentración Alanina, Isoleucina, Arginina, Treonina y Cistina.

Si se conocen los parámetros tecnológicos del proceso, el varietal de uva y el tipo de levadura lo mismo que los tratamientos del suelo y las condiciones climáticas, el contenido de aminoácidos podrá ser tomado como "Índice de genuinidad" o "huella dactilar" del vino producido.

SUMMARY:

Following with the research project approved by Universidad Nacional de Lanús, the manufacturing of red and white wines was done, at a pilot scale using different strains of yeast from the domestic market. Simultaneously, a series of analytical parameters and specially an aminogram in the grapes, musts and wines produced using RP-HPLC with fluorescent detection was controlled. It was observed that Proline was the predominant amino acid in the whole process involved in viniculture. Alanine, Isoleucine, Arginine, Threonine and Cystine were also present at lower concentration.

If the technological parameters of the process, the variety of grapes an type of yeast, together with the treatments of the soil and weather conditions are known, the content of amino acids shall be able to be taken as a "genuinity index" or "finger print" of the produced wines.

INTRODUCCIÓN:

Una empresa local productora de vinos facilitó que nuestros docentes y alumnos de la Cátedra de Industria y Tecnología V (Fermentaciones) de la Carrera de Alimentos pudieran realizar experiencias a escala piloto usando parámetros industriales. Se decidió entonces obtener vinos propios utilizando cepas disponibles en el mercado de Saccharomyces cerevisiae var. Bayanus, var. Ellipsoides y flora nativa.

Venimos de realizar un trabajo de investigación en una matriz alimenticia alcohólica (1) determinando los aminoácidos libres y amonio más representativos de muestras nacionales e internacionales del mercado local. Hacemos mención de un excelente artículo (2) acerca de la determinación de aminoácidos en fermentaciones alcohólicas.

Nuestra intención desde el inicio de la experiencia fue verificar el comportamiento allí descrito en una nueva matriz alcohólica como son los vinos.

En el diseño experimental consideramos 5 semanas para obtener dichos vinos partiendo de uvas Merlot, provenientes de la Provincia de San Juan, y Torrontés de la Provincia de Salta. Las uvas adquiridas tenían un alto grado de maduración.

Se tomaron muestras representativas a tiempo cero y durante las siguientes 4 semanas (una por semana). Los parámetros esenciales de la fermentación fueron controlados con metodología oficial del Instituto Nacional de Vitivinicultura de la Argentina. Ellos fueron: pH, acidez total, azúcares reductores, sulfito libre y grado alcohólico.

Cabe preguntarse ¿porqué nos interesan los aminoácidos en este estudio enológico?

• por ser la fuente de nitrógeno más importante de asimilación de la levadura. Es decir que los aminoácidos son nutrientes fundamentales para el desarrollo y reproducción del organismo durante la fermentación alcohólica.




• Porque la velocidad de fermentación dependerá de la calidad y cantidad de aminoácidos en el mosto. Además, dichos analitos son precursores de las propiedades organolépticas del vino al transformarse en alcoholes, aldehidos, ésteres, ácidos dicetónicos, etc (principales responsables del flavor) (3).




• Como criterio de genuinidad es decir de no adulteración, los aminoácidos están desplazando (en diferentes países) a otros criterios hasta ahora usados como son los pigmentos (por ejemplo antocianinas) presentes originalmente en la uva y en el vino por ser más estables, seguros y confiables.




• Si hay baja calidad y cantidad de aminoácidos habrá baja población de levaduras y por lo tanto posibilidad competitiva de otros microorganismos. Por el contrario, un exceso en cantidad producirá un gran crecimiento de levaduras afectando el aroma del vino.




• El contenido en aminoácidos de las uvas es dependiente de las condiciones climáticas, el cultivo, los tratamientos del suelo y las prácticas realizadas sobre el mismo(3) .




• En fin, concluimos diciendo que conocer estos parámetros analíticos cuali y cuantitativamente podrían ser tomados en cuenta como INDICES DE GENUINIDAD O HUELLA DACTILAR de los vinos producidos.

Con respecto a la metodología analítica que utilizamos, la clásica es la determinación por RP-HPLC de derivatización. Consultada la bibliografía internacional sobre el tema, nos encontramos solamente con la bibliografía (4), quien presenta una síntesis de los diversos derivatizantes usados: OPA, FMOC, Cloruro de dansilo, PITC, etc. Existe una referencia (6) similar a la metodología usada por nosotros.

También se determinó la proteína existente en cada muestra del experimento.

En fin, los objetivos del presente trabajo son ya sea la identificación del perfil de aminoácidos libres de 3 varietales argentinos ya que estos analitos juegan un importante rol en el progreso de la fermentación y en la formación bioquímica de alcoholes de alto peso molecular y, por otra parte, tratar de caracterizar los vinos argentinos por el conocimiento de sus perfiles aminoacídicos (aminograma).

El trabajo presentado a continuación muestra los resultados obtenidos oportunamente, siendo desde todo punto de vista totalmente original en Argentina. Hacemos notar que varios países están trabajando intensamente al respecto para de esta manera tipificar sus producciones asegurándole mejor calidad (Francia, Chile, Alemania, Italia, etc.)(3).

MATERIALES Y MÉTODOS:

Uvas: las materias primas fueron compradas (inicios de abril) en el mercado local. Como fue indicado previamente, las uvas estaban muy fermentadas. Se realizó un recuento de población inicial y se encontró 40 millones de UFC/mL para Merlot y de 10 millones de UFC/mL para Torrontés.

Se colocaron en cada tanque de fermentación de la empresa local aproximadamente 100-110 Kg de uva obteniendo 60-70 litros de mosto y se siguió el protocolo que a continuación se detalla:

Toma de la muestra y preparación para el análisis:

A partir de la primera semana, el hollejo se separa (sin moverlo) para permitir entrar el sacamuestras hasta el fondo del tanque. Se obtuvo muestras por duplicado para poder realizar todos los análisis previamente descriptos. Las muestras tomadas para determinación de los aminoácidos fueron congeladas a -20ºC hasta su análisis.

Las mismas fueron filtradas por papel de filtro SS banda azul para retener el material grueso. A cada filtrado se le agregó 2 gotas de hidróxido de sodio 1 N/mL de filtrado para obtener un pH aproximado a 6. Cuando no fue neutralizado y el pH del mosto era bajo no se puede lograr la acción del buffer del reactivo de derivatización.

Las muestras se filtraron por filtros Millex LCR 13 y se toman 200 mL de muestra a las que se les agrega 4 mL de Estándar Interno AABA 2.5 mM más 800 µL de agua.

Se tomaron 10 mL de dilución anterior a la que se le agregó 70 mL de buffer y 20 mL de reactivo Accutag. Se vorterea, se calienta a 50ºC 5 minutos y se inyectan 5 mL de aminoácidos derivatizados.

Las referencias internacionales (4-6) recomendaban que la muestra fuera desproteinizada con etanol, luego centrifugada y finalmente rotoevaporada para eliminar el solvente. Filtrar finalmente por membrana con cut-off 1000. Pero esta técnica fue descartada por ser más cara que la que finalmente usamos.

Preparación del estándar de aminoácidos:

Se partió del kit Accutag del que se tomó 200 mL del estándar de aminoácidos 2.5 mM (cistina está 1.25 mM) a la que se le agregó 4 mL de Estándar Interno AABA (ácido alfa-aminobutírico) 2.5 mM más 800 mL de agua. Se tomó 10 mL de la dilución y se procedió como en la muestra.

El inyectar 5 mL representa 50 pmol de cada aminoácido menos cistina que está a 25 pmoles.

El orden de elución es el siguiente: AMQ, Ácido Aspártico, Serina, Ácido Glutámico, Glicina, Histidina, Amoníaco, Arginina, Treonina, Alanina, Prolina, Cistina, Tirosina, Valina, Metionina, Lisina, Isoleucina, Leucina y Fenilalanina.

Reactivos:

- Acetonitrilo grado HPLC de J.T.Baker
- Agua calidad HPLC: obtenida por filtración con Milli-Q.

Todos los solventes fueron filtrados diariamente por filtros Millipore GVWP 04700.

El estándar interno AABA es marca SIGMA
El kit AccQ-Tag es marca registrada de Waters Corporation (D'Amico Sistemas, Buenos Aires).

Instrumental:

Cromatógrafo líquido Agilent Modelo 1050 compuesto por: Bomba cuaternaria, desgasificador en línea por vacío, inyector automático y horno para la columna, conectores para microbore.

Detector fluorimétrico Modelo 1046 con celda de 1 mL.

Integrador HP 3396 II.

Condiciones cromatográficas:

Columna Hypersil ODS de 200 mm x 2.1 mm. El diámetro de partícula es de 5 mm y el diámetro de poro es de 12 hm. Se usó guardacolumna de 3.9 x 20 mm rellena con fase reversa, compatible con la columna analítica.

Gradiente ternario compuesto por la línea A de buffer con pH 5.05; la línea B es acetonitrilo y la C es Agua HPLC.

El gradiente ternario fija la corrida en aproximadamente 30 minutos incluyendo el reequilibrio de la columna.

El usar reactivos de baja calidad es una fuente de contaminación del gradiente y por lo tanto la aparición de picos espurios.

Si se trabaja a pH 4.95 se mejora notablemente la resolución del AMQ/Asp (esto es importante en la detección UV, no así en la fluorimétrica usada por nosotros).

Si el pH del buffer está en 5.80 se mejora la resolución de Serina y Asparragina.

Disminuyendo la pendiente del gradiente entre 0.5 y 18 minutos se mejora la resolución general pero se desmejora la resolución Gli/Hist y Arg/Treo.

Flujo: 0.33 mL/min.

Longitud de onda de excitación: 250 hm; longitud de onda de emisión de la fluorescencia: 395 hm.

Temperatura de la columna: 40ºC.

Volumen de inyección: 5 hL.

La identificación se hizo sobre la base de los tiempos de retención y al orden de elución indicado previamente.

Validación del método:

La repetibilidad fue examinada mediante 5 inyecciones consecutivas de la misma muestra en el día de trabajo. La Tabla I informa los desvíos estándar obtenidos para los aminoácidos principales.

La reproducibilidad en diferentes días también fue examinada inyectando los mismos estándares 5 veces en el periodo de 2 semanas. En todos los casos el Coeficiente de Variación de las concentraciones calculadas de los aminoácidos más importantes fue menor al 5 %.

La linealidad de la respuesta fluorimétrica se constató usando 4 concentraciones diferentes de los aminoácidos estándares de modo que cubrieran los niveles de los aminoácidos más importantes en uvas, mostos y vinos. Se construyeron curvas de calibración para los aminoácidos más importantes.

El análisis de regresión lineal mostró coeficientes de correlación, r, entre 0.95 y 0.98. El cálculo de las concentraciones de aminoácidos se realizó en base al estándar interno AABA y a su constancia en los resultados obtenidos. Se controló también con relación a las concentraciones de los estándares externos (2.5 mM y 1.25 mM respectivamente).

RESULTADOS:

DATOS DE AZÚCARES REDUCTORES, SULFITO Y ACIDEZ:

Al finalizar la primera semana de iniciada la fermentación se obtuvieron los siguientes datos:

A la segunda semana de iniciada la fermentación se agregan 40g de sulfito de sodio a los tanques 4 y 5 (para poder conservarlo ya que finalizó la fermentación y pretendemos bloquear la fermentación secundaria o malo-láctica y también evitar el crecimiento de posibles hongos). Los resultados obtenidos son:

CONTROLES REALIZADOS DEL SULFITO LIBRE:

Los resultados fueron:

DATOS OBTENIDOS DE LA VARIACIÓN DE ALCOHOL Y DE AZUCAR DURANTE LA VINIFICACIÓN:

DATOS OBTENIDOS DE AMINOÁCIDOS:

La Tabla I presenta los resultados comparativos de la investigación, expresados como rango en ppm, de todos los aminoácidos (n = 5) presentes en los vinos blancos (Torrontés) para los diferentes tiempos de elaboración previamente definidos.

Hacemos notar que se ha estudiado solamente la precisión de los aminoácidos más significativos.

La Tabla II presenta los resultados comparativos de la investigación, expresados como rango en ppm de todos los aminoácidos (n=5) presentes en el vino tinto (Merlot) para los diferentes tiempos de elaboración.

Como anteriormente se ha indicado, se estudió solo la precisión de los aminoácidos más significativos.

Los valores de aminoácidos encontrados se encuentran en las Tablas I y II. Descargar PDF.

TORRONTES:

MERLOT:

Los gráficos 1 y 2 muestran los datos de concentración, ppm, de Prolina (Torrontés y Merlot respectivamente) en función del tiempo para las 3 levaduras usadas.

Los gráficos 3, 4 y 5 muestran la variación de concentración, ppm, de los aminoácidos más importantes encontrados en Torrontés para Saccharomyces var. bayanus, var. ellipsoides y flora nativa respectivamente.

Los gráficos 6, 7 y 8 lo mismo que anteriormente para Merlot.

El gráfico 9 presenta los datos de la concentración, ppm, de proteínas en vinos blancos y su evolución durante el proceso (n=5 y CV= 4.2%).

El gráfico 10 presenta los datos de la concentración, ppm, de proteínas en vinos tintos y su evolución durante el proceso (n=5 y CV=4.9 %).

La técnica oficial para la determinación de las proteínas en vinos es el Kjeldahl. Se usó el método del Rojo de Pirogalol (PROTIU/LCR) de Wiener Laboratorios, Rosario, República Argentina, previo contraste con Kjeldahl, debido a que es una metodología que determina proteínas en muy bajas concentraciones. Otras metodologías probadas fueron Folin-Ciocalteau y Meulemanns. Para el primero de ellos, al precipitar la proteína con el ácido tricloroacético, éste arrastraba junto con la misma otros compuestos adsorbidos. Fue por tanto desechado ya que al reconstituirse el precipitado se obtenían resultados poco reproducibles. Meulemanns, por el contrario, fue descartado especialmente en los vinos tintos ya que las antocianinas cambiaban fuertemente de color al agregarle el reactivo.

ESTUDIO DE LAS INTERFERENCIAS DEBIDAS AL EFECTO MATRIZ:

Se realizó adiciones estándar a diferentes matrices de vinos blancos. Para ello se prepararon soluciones estándar de los principales aminoácidos y se añadieron (0-20-40-60 microlitros) a series de 250 microlitos de muestras de vino.

Todas las muestras fueron derivatizadas con Accutag por triplicado y después separados los aminoácidos como fue descrito previamente.

Como se observa, el CV es menor del 5 %. De esta forma podemos asegurar que la exactitud es buena y que no hay interferencias debidas a la matriz.

CONCLUSIONES:

1. Prolina es el aminoácido (en realidad iminoácido) predominante en el producto final (11). Se cumple perfectamente lo predicho por Margaret Jones en la matriz cerveza (2), es decir que no es metabolizado por ninguna especie de levadura (grupo D) en condiciones de anaerobiosis. De todos modos hay un consumo inicial y luego se produce la meseta.




2. Surge a continuación la pregunta de porque en el vino blanco los valores de este aminoácido ascienden para después buscar la meseta como en el Merlot. Es más lógico lo que ocurre con esta última en donde de un valor inicial alto el proceso fermentativo lleva a Prolina a buscar una meseta. Deducimos que lo que ocurre en el Torrontés es una consecuencia del sulfito agregado y a la lisis parcial de la población nativa. En el futuro seguiremos trabajando este tema.




3. El segundo aminoácido en importancia cuantitativa es Alanina: esto también coincide con la referencia (2) ya que este aminoácido pertenece al grupo C, es decir a los analitos que son absorbidos por la levadura después de un periodo de latencia.




4. Los aminoácidos que aparecen en tercer nivel son Isoleucina y Arginina (en ambos vinos), Treonina (blanco) y Cistina (tinto): todos ellos pertenecen al grupo B (2): la levadura los absorbe lentamente.




5. La fuente de aminoácidos en el mosto son los polipéptidos productos de la proteólisis de las proteínas presentes inicialmente en la uva. Vitis vinífera contiene aproximadamente 500-1500 ppm de proteína .La proteína residual en el vino es del orden de 50-200 ppm (7). En el vino blanco los valores de proteínas están dentro de lo que dice la referencia mientras que en el tinto es aproximadamente 10 veces mayor y ello es debido a que los suelos fueron extra fertilizados y a la edad del viñedo (datos aportados por el productor de la uva). En el futuro profundizaremos este aspecto.




6. La bibliografía internacional (3-6) estipula que en los vinos, los aminoácidos libres, determinados por técnicas cromatográficas varias están en las siguientes concentraciones: Prolina: 700-1500 ppm; Alanina: 70-150 ppm; Arginina: 20-150 ppm; Isoleucina: 10-80 ppm; Cistina: 10-100 ppm; Treonina: 20-60 ppm. Nuestros resultados son bastante concordantes con las referencias internacionales salvo el caso de Prolina en donde encontramos 10 veces más en los mostos tintos (explicable por el mayor porcentaje de proteína encontrada) y cerca de 8 veces más en los mostos blancos. Creemos que ello se debe a la sensibilidad del método para cuantificar a este iminoácido. En las referencias bibliográficas citadas, ninguno de los métodos usados tiene la sensibilidad tan alta para Prolina (a nivel femtomoles de aminoácidos), inclusive se usan metodologías que no lo cuantifican como es la metodología OPA (3).




7. Como venimos afirmando desde que comenzamos a trabajar con aminoácidos el tema de genuinidad (1,8-10), si se conocen los parámetros tecnológicos del proceso y se correlaciona con los aminoácidos libres presentes, será posible fijar la calidad del producto obtenido. Por ello consideramos que los aminoácidos son huellas dactilares importantes e inclusive pueden desplazar a las antocianinas como se viene haciendo en la actualidad. Recordar que no solo se debe tener en cuenta lo predicho sino que también se deberá considerar las relaciones clima, suelo, abonado, lugar geográfico, edad de los viñedos, el rol de los aminoácidos como precursores de aminas biogénicas, etc.




8. Además de todo lo dicho previamente, la presencia/ausencia de estos analitos fijará también el flavor del vino por las transformaciones que sufren los aminoácidos dando alcoholes superiores muy particulares, aldehidos, ésteres, ácidos dicetónicos, etc.




9. El contenido en aminoácidos libres del mosto y de las uvas depende fuertemente del varietal usado de uva y al mismo tiempo del tipo de levadura: la nativa consume menos Prolina que las otras.




10. En el futuro produciremos vino usando el mismo proceso pero cambiando de zonas geográficas argentinas, estadios madurativos, etc.

BIBLIOGRÁFÍA:

1. Giraudo M., Sanchez Tuero H., Pomilio A., Pavesi R., Markowski I., Guirin G., Montesano J., Determination of free amino acids and ammonium in blonde and black beers and malts of the argentinian market by rp-hplc with fluorescent detection, Alimentaria 359, 85-89 (2004).
2. Pierce, The Margaret Jones memorial lecture: amino acids in malting and brewing, J. Int. Brew. 88,228(1982).
3. Soufleros E., Bouloumpasi E., Tsarchopoulos L., Primary amino acid profiles of Greek white wines and their use in classification according to variety, origin and vintage, Food Chemistry 80, 261-273 (2003).
4. Carnevillier V., Schlich P., Guerreau J., Characterization of the production regions of Chardonnay wines by analysis of free amino acids, Vitis 38,37(1999).
5. Hernández Orte P., Guitart A., Cacho J, Amino acids determination in musts and wines by hplc after derivatization with phenlisothiocyanate, Am. J. Enol. Vitic. 48, 229(1997).
6. Hernández Orte P., Ibarz M., Cacho J., Amino acids determination in grape juices and wines, Chromatographia 58,29-35 (2003).
7. CENEXA, Tablas de composición química, 1995.
8. Giraudo M., Sánchez Tuero H., Muset G., Pavesi R., Castañeda R., Fernández M., Noseda D., Markowski I., Guirin G., Determinación cuantitativa de aminoácidos en quesos reggianito argentino por derivatización con 6-AQC y rp-hplc, Alimentaria 337,121-126 (2002).
9. Giraudo M., Sánchez Tuero H., Pavesi R., Markowski I., Guirin G., Montesano J.,, El proceso productivo de los jugos cítricos y la determinación de los aminoácidos libres por rp-hplc en jugos frescos y concentrados como criterio de genuinidad, Alimentaria 350,97-102 (2004).
10. Asensio M., Valdes E., Characterization of some spanish white grape wine cultivars by morphology and amino acids analysis, Scientia-Horticulturae 93,(3/4), 289-299 (2002)
11. Lehtonen P., Determination of amines and amino acids in wine. A review, Am. J. Enol. Vitic. 47,127-133(1996).

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